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海洋发光细菌和淡水发光菌

阅读人数:419 发布时间:2019/6/6 11:21:39

      发光细菌作为毒性检测的生物学方法,因其简便、快速、灵敏且成本较低而日益受到重视。本试验项目推荐两个方法。一为国家环境保护局于1995年发布的发光细菌法(GB/T15441-1995),采用的是海洋发光细菌菌种;二为淡水发光菌法,采用的是淡水型发光菌种。
明亮发光杆菌T3法(A)
本方法适用工业废水、纳污水体及实验室条件下,可溶性化学物质的水质急性毒性监测。
1.原理
基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关(P≤0.05),因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度,以此表示其急性水平。
水质急性毒性水平可按选用相当的参比物 HgCl2浓度(以mg/L为单位)来表征,或选用EC50值(半数有效浓度,以样品液百分浓度为单位)来表征。
2.样品的采集与保存
①采样瓶使用聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶,务必清洁、干燥。采集水样时,瓶内应充满水样不留空气。采样后,用塑胶带将瓶口密封。
②毒性测定应在采样后6h内进行。否则应在生化培养箱2-5℃下保存样品,但不得超过24h。报告中应写明水样采集时间和测定时间。
③对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除,以免干扰测定。
3.仪器设备
①生物发光光度计:配置2ml或5ml测试管。
当 HgCl2标准溶液浓度为0.10mg/L时,发光细菌的相对发光度为50%,其误差不超过±10%。
②2ml或5ml测试样品管(具标准磨口塞,为制造比色管的玻璃料制作,由专业玻璃仪器厂制造),分别适用于相应型号的生物发光光度计。
③微量注射器:10μl。
④注射器:lml。
⑤定量加液瓶:5ml。
⑥吸管:2ml、10m1、25ml。
⑦试剂瓶:l00ml。
⑧量筒:100ml,500ml。
⑨棕色容量瓶:50ml、250ml、1000ml。
⑩半微量滴定管(配磨口试液瓶,全套仪器均为棕色):l0ml。
4.试剂和材料
除另有说明外,本方法所用试剂均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。
① HgCl2。
②氯化钠NaCl,化学纯。
③明亮发光杆菌T3小种(PhotobacteriumphosphoreumT3spp.)冻干粉,安瓶瓶包装,每瓶0.5g,在2-5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细胞;当按5(3)④步骤将冻干粉复苏2min后即发光(可在暗室内检验,肉眼应见微光),稀释成工作液后每毫升菌液不低于1.6万个细胞((5ml测试管)或2万个细胞(2ml测试管)(均为稀释平板法测定)。在生物发光光度计上测出的初始发光量应在600-1900mV之间,低于600mV允许将倍率调至“×2”档,高于1900mV允许将倍率调整至“×0.5”档。仍达不到标准者,更换冻干粉。
④氯化钠溶液,3g/100m1:取氯化钠3g于玻璃容器内,用量筒加蒸馏水l00ml。
⑤氯化钠溶液,2g/l00ml取氯化钠2g,加蒸馏水l00ml于试剂瓶内,2-5℃保存。
⑥参比物 HgCl2标准溶液:0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。
⑦ HgCl2母液,ρ=2000mg/L:1/万分析天平精称密封保存良好的无结晶水 HgCl20.1000g于50ml容量瓶中,用3g/100m1氯化钠溶液稀释至刻度,置2-5℃冰箱备用,保存期6个月。
⑧ HgCl2工作液,ρ=2mg/L:用移液管吸 HgCl22000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中,用3g/l00ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取 HgCl220mg/L液25ml于250m1容量瓶中,用3g/l00m]氯化钠溶液定容。将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶,然后用3g/l00ml氯化钠溶液,将 HgCl22mg/L溶液按表5-3-6稀释成系列浓度(一律采用50ml容量瓶)。 HgCl2工作液保存期不能超过24h,超过者务必重配。
5.试验程序
(1)稀释样品液
①样品液测定前稀释的条件:
样品液预试验:取事先加氯化钠至3g/l00ml浓度的样品母液2m1装入样品管,并设一支CK管(氯化钠3g/100m1溶液),按4②一③所述测定相对发光度。
若测得的样品,相对发光度低于50%乃至零,欲以EC50表达结果,则需稀释。
若测得的样品,相对发光度在1%以上,欲以与相对发光度相当的 HgCl2浓度表达结果,则不需稀释。
②样品液的稀释液:样品液的稀释液一律用蒸馏水,在定容前一律按构成氯化钠3g/100ml的浓度添加氯化钠或浓溶液(母液只能加固体)。
③样品液稀释浓度的选择:
预试验:按对数系列将样品液稀释成五个浓度:100%、10%、1%、0.1%、0.01%(其对数依次为0、-1、-2、-3、-4),按5(2)和5(3)所述粗测一遍,视1%-100%相对发光度落在哪一浓度范围。
正式试验:在1%-100%相对发光度所落在的浓度范围内增配到6-9个浓度(例如,若落在0.1%-10%之间,则应稀释成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%;若落在1%-10%之间,则应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%),按5(2)-(3)所述再测一遍;这6-9个浓度,也可通过查对数表,按等对数间距原则自行确定(例如,若落在1%-10%之间,则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其对数相应为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00,对数间距均为0.2)。
(2)测定条件
①室温:20-25℃。
同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃,且所有测试器皿及试剂、溶液测前1h均置于控温的测试室内。
②pH:若需测定包括pH影响在内的急性毒性,不应调节待测样品pH。
若需测定排除pH影响在内的急性毒性,需在测定前将待测样品和CK(氯化钠3g/100m1)的pH调至下值:主要含Cu的水样为4.5,主要含其他金属的水样为5.4,主要含有机化合物的水样为7.0。
③溶解氧:本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。
(3)测定步骤
①试管的排列:于塑料或铁制试管架上按以下两种情况排列测试管。
a.按5(1)①所述,样品母液相对发光度为1%以上者,如下排列:
左侧放参比物 HgCl2系列浓度溶液管,右侧放样品管。前排放 HgCl2溶液和样品管,后一排放对照(CK)管,后二排放CK预试验管。每管 HgCl2或样品液均配一管CK(氯化钠3g/100m1蒸馏水溶液)。设三次重复。每测一批样品,均需同时配置测定系列浓度 HgCl2标准溶液。
b.按5(1)①所述,样品母液相对发光度为50%以下乃至零者,如下排列:
左侧仅放 HgCl20.10mg/L溶液管(作为检验发光细菌活性是否正常的参比物浓度,其反应15min后的相对发光度应在50%左右),右侧放样品稀释液管(从低浓度到高浓度依次排列)。其他同a。每测一批样品,均需同时配测 HgCl20.10mg/L溶液。
②加3g/l00ml氯化钠溶液:用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2m1或5ml氯化钠3g/l00ml(据仪器型号而定)。
③加样品液:用2ml或5ml吸管给每支样品管加2ml或5ml样品液(据5(3)②而定)。每个样品号换一支吸管。
④发光细菌冻干菌剂复苏
从冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和氯化钠溶液,投入置有冰块1-1.5L保温瓶,用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化钠2g/l00m1(适用于5ml测试管)或lml冷的2.5%氯化钠(适用于2m1测试管)注入已开口的冻干粉安瓿瓶,务必充分混匀。2min后菌即复苏发光(可在暗室内检验,肉眼应见微光)。备用。
⑤仪器的预热和调零:打开生物发光光度计电源,预热15min,调零,备用。
⑧检验复苏发光细菌冻千粉质量:另取一空2m1或5ml测试管加2m1或5ml氯化钠3g/100ml(据5(3)②而定),加10μ1复发光菌液,盖上瓶塞,用手颠倒五次以达均匀。拔去瓶塞,将该管放入各自型号仪器测试舱内,若发光量立即显示(或经过5-l0min上升到)600mV以上,此瓶冻干粉可用于测试,低于者按4③处理。菌液发光量先缓慢上升,约持续5-15min,后缓慢下降,约持续4h。满4h的CK发光量应不低于400mV,低于者更换冻干粉。
⑦给各测试管加复苏菌液:在发光菌液复苏稳定(约0.5h)后,按5(3)所述,从左到右,按 HgCl2或样品管(前)-CK管(后)一 HgCl2或样品管(前)-CK管(后)…顺序,用10μl微量注射器(勿用定量加液器以减少误差)准确吸取10μl复苏菌液,逐一加入各管,盖上瓶塞,用手颠倒五次,拔去瓶塞,放回原位(每管加菌液间隔时间勿短于30s。每管在加菌液的当时务必精确计时,记录到秒,即为样品与发光菌反应起始时间。立即将此时间加15min,记作各管反应终止(即应该读发光量)的时间。
⑧发光细菌与样品反应达到终止时间的读数:按各管原来加菌液的先后顺序,当某管达到记录的反应终止时间,在不加瓶塞的情况下,立即将测试管放入仪器测试舱,读出其发光量(以光信号转化的电信号一电压毫伏数表示)。
⑨有色样品测定干扰的校正:
a.拿掉仪器样品舱上的黑色塑料管口;
b.取-2m1测试管(直径12mm),加氯化钠3g/ml溶液2m1,将该管放进一装有少量氯化钠3g/100m1溶液的5ml管(直径20mm)内,要使外管与内管的氯化钠3g/l00ml液面平齐。此作CK管;
c.另取一2ml测试管,加氯化钠3g/ml溶液2ml,放入另一装有少量有色待测样品液的5ml管内,要使外管与内管的氯化钠3g/ml液面平齐。此作CKc管;
d.于CK和CKc二管的内管中同时加复苏发光菌液10μ1(注意:必须是本批样品测
定所用同一瓶复苏菌液),立即记时到秒,等反应满15min,迅速放入仪器测试舱,测定两支带有内管的5ml测试管的发光量。分别记下发光量Ll(CK管)和L2(CKc管);
e.计算因颜色引起的发光量(mV)校正值ΔL=L1一L2;
f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常规步骤测试带色样品管及其CK管(氯化钠3g/l00ml溶液)的发光量(mV)。所有CK管测得之发光量(mV)均须减去校正值ΔL(mV)后才能作为CK发光量(mV)。
有色样品溶液测定干扰的校。
6.质量保证与质量控制
①每支发光菌的发光强度和稳定性不尽相同,同批样品测定过程中应使用同一支发光菌,如果需做 HgCl2标准曲线,也应与样品使用同一支发光菌。如果一支不够用,可采用同批的两支混合后使用。
②国际上一般通用反应时间为5min或15min两种,鉴于我国目前所用发光杆菌的灵敏度和稳定性,采用15min。
③三次重复测定结果相对偏差确定为≤1%。
④测定应在采集样品后立即进行,在6h内不能测定应低温保存,但不得超过24h。
⑤关于样品如何稀释的问题,一般根据样品毒性大小决定,但是在试验中至少要选择六个不同浓度。如果六个浓度的相对发光度在1%-100%之外,可增配若干个浓度,使之落在1%-100%相对发光度范围内,以求相关方程。
⑥如果样品浓度为极限浓度(即100%)时,其相对发光率都不能使发光强度减少50%,则对样品的EC50值只能示为>100%。
⑦鉴于发光细菌法实验因素的影响,实验结果具有一定误差。在评价毒物的剂量一效应关系时,应确定95%置信区间,即T=a+bC±2SE(SE为剩余标准差),以此求出的EC50也有一定的区间,可根据这些结果确定实验结果的准确性和真实性。对于实验结果的重现性,就大多数而言,一般EC50值的变异系数在6%-10%。
7.测试结果的表达
1)计算样品相对发光度(%),并算出平均值:
相对发光度(%)= HgCl2管或样品管发光量(mV)/CK管发光量(mV)×100
相对发光度(%)平均值=(重复1)(%)+(重复2)(%)+(重复3)(%)/3
2)符合5(1)①中样品母液相对发光度在1%以上者,建立并检验 HgCl2浓度(C)与其相对发光度(T,%)均值的相关方程,也可以绘制关系曲线。
①求出一元一次线性回归方程的a(截距)、b(斜率、回归系数)和r(相关系数),列出方程:
T=a+bC HgCl2
查相关系数显著水平(P值)表,检验所求r值的显著水平。若P≤0.01,且EC50 HgCl2=0.lomg/L±0.02mg/L,则所求相关方程成立;反之,不能成立,必须重测系列 HgCl2浓度的发光量。 HgCl2溶液配制过夜者,必须重配后再测定。
②也可以据建立的上述方程绘制关系曲线。即指定发光度为10%和90%,代入上式,求出相应的二个 HgCl2浓度,在常数坐标纸上,定出二点,画一直线,即为符合该方程的 HgCl2浓度与相对发光度的关系曲线。
3)符合5(1)①中样品母液相对发光度低于50%乃至零,欲以EC50表示结果者,建立并检验样品稀释浓度(C)与其相对发光度(T)均值的相关方程,绘制关系曲线。
按7之2)所述方法建立相关方程T=a+bC样,并检验相关系数r、显著水平(P值)。
若P≤0.05,则所求相关方程成立;反之,不能成立,必须重测样品稀释系列浓度的发光量。
8.结果评价和报告
(1)用 HgCl2浓度表达样品毒性
1)适用的条件:符合条件(样品母液相对发光度>1%)并按7之2)建立了合格((P≤0.01、EC50 HgCl2=0.10mg/L±0.02mg/L)的 HgCl2浓度与其相对发光度相关方程者。
2)表达方法:
①将测得的样品相对发光度,代入7之2)的相关方程,求出与样品急性毒性相当的 HgCl2浓度(一般用mg/L)表示。
②测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的 HgCl2浓度值。
3)适用性:适用于相对发光度在1%以上,特别是50%以上(即不可能出现EC50值)但低于100%(即仍有中、低水平毒性)的样品毒性测定。
(2)用EC50值表达样品毒性
1)适用的条件:符合条件(样品母液相对发光度低于50%乃至零)并按7之3)建立了合格(P≤0.01)的样品稀释液浓度与其相对发光度相关方程者。
2)表达方法:
①将T代入7之3)建立的相关方程,求出样品的EC50值。这里的EC50值以样品的稀释浓度(一般用百分浓度)表示。
②测试结果报告列举样品的EC50值。
3)适用性:适用于相对发光度在50%以下,特别是零(即毒性水平较高或很高)的样品毒性测定,后者无法以相当的 HgCl2浓度表达毒性。
(3)测定记录格式
(4)测定结果报告
①实验室室温。
②采样地点、日期、时间。
③ HgCl2浓度或样品稀释百分浓度与相对发光度的相关方程:
T=a+bC
r= P≤ EC50 HgCl2= mg/L
L=a+bC a= b=
回归方程 r= P<
④样品EC50值(稀释百分浓度)或相对发光度(%)及相当的 HgCl2浓度(mg/L)。
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