联系人:欧阳经理
电 话:17321152016
手 机:17321152016
地 址:上海市浦东新区瑞庆路528号18幢(张江高科现代医疗器械园)
邮 编:201201
邮 箱:zhushumin@zhetu.com
手机网站:m.zhetu17.com.cn
点击次数:1983 发布时间:2024/3/21 11:10:42
用Trizol来提取细胞总RNA的话,一个6孔板的细胞足够了。对于贴壁培养的细胞,可将培养基吸出后直接向培养板中加入Trizol来溶解细胞,然后分次移出细胞裂解物进行后续操作即可。值得注意的是,对于所加Trizol的量,是依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定用量的(一般每10cm2加1ml)。当Trizol量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。另外,在Trizol的使用说明中的注意事项提及,如果细胞量太少(100~10000个细胞),可加入800ul的Trizol,后续裂解、加按常规操作。在用异丙醇沉淀RNA加入5-10ug无RNA酶的糖原作为水相的载体。其会保留在水相,与RNA共沉淀,且不影响后续的逆转录及PCR反应。
加入1ml TRIzol裂解细胞(用手剧烈摇晃),装入1.5ml Eppendorf管中,冰上放置10min。
加入200μl,震摇15s,冰上放置5min。
13500rpm,4℃离心15min。
收集上清水相一般为500uL,加入等体积异丙醇,上下颠倒混匀,冰上放置10min。
13500rpm,4℃离心10min,弃上清。
加入1ml的75%乙醇,上下颠倒混匀后冰上放置5min,12000rpm,4℃离心5min。
弃上清,待残余乙醇挥发殆尽后,沉淀重悬于20μl用DEPC处理水中,存于-70℃。
用分光光度计测OD260/280nm波长的吸光值鉴定RNA浓度,以琼脂糖凝胶电泳证实其完整性。10-5细胞数,提取的浓度一般检测为500-1000ug/mL
原创作者:上海喆图科学仪器有限公司